本发明提供了一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒，包括扩增金黄色葡萄球菌的引物、扩增表皮葡萄球菌的引物、扩增无乳链球菌的引物、扩增停乳链球菌的引物、扩增乳房链球菌的引物、扩增肠球菌的引物、扩增铜绿假单胞菌的引物、扩增肠杆菌的引物、扩增大肠埃希菌的引物、扩增肺炎克雷伯菌的引物、扩增单增李斯特菌的引物和扩增牛支原体的引物。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测奶牛乳腺炎的方法。本发明的方法具有操作便捷、无需特殊仪器、成本低廉的特点，不仅能为养殖场的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，具备大规模推广应用的条件。