本申请涉及生物信息技术领域，尤其涉及基于全基因组测序的多态性分子标记和制备方法及应用；所述分子标记包括81组引物对，引物对的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.162所示；所述方法包括：将五丰B和广恢308的基因组DNA建库和测序，得到原始数据，质控筛选，得到有效数据；将有效数据和参考基因组比对组装，得到比对文件；得到五丰B和广恢308的一致性序列；比对一致性序列，得到InDel位点；根据InDel位点，得到设计引物序列；将设计引物序列在基因组中检索比对，得到标记引物；PCR扩增和电泳检测，得到电泳结果图；根据电泳结果图，判断标记引物是否为多态性分子标记；所述应用包括：将分子标记用于水稻遗传图谱构建、QTL定位、分子标记辅助育种及遗传多样性分析中。