本发明公开了一种水体污染溯源方法，包括如下步骤：在检测出污染的取样水域采用在线生物监测预警技术判断潜在污染源；对各潜在污染源取水样，并采用污染溯源分析：首先，对多浓度梯度的污染物水溶液进行全光谱荧光激发检测，并记录其三维荧光光谱中荧光数据，多次采集并将物质特征数据记载形成数据库，并在数据库中固定采集间隔期的采集记录无污染水体全光谱扫描下的三维荧光光谱；对各潜在污染源所取水样进行全光谱扫描荧光激发检测，检测结果与先前数据库荧光特征进行相似度比对，相对于无污染情况，可以将被监测水体的三维荧光指纹谱同潜在污染源的典型三维荧光指纹谱进行对比，包括荧光峰识别与图谱相似度比较，从而确定潜在的污染来源。