本发明属于激素检测技术领域，涉及一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法。针对现有技术中雌激素在生物样本和人体内以痕量水平存在，在干血片样本中含量极低，雌激素化合物极性较小，在质谱中ESI和APCI源中离子化效率不高，直接检测灵敏度不高的技术问题，本申请提供一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，包括衍生化试剂、第一萃取剂和第二萃取剂，萃取和衍生化前处理结合超高效液相色谱串联质谱能快速简便准确的检测出干血片中痕量的雌激素。本申请还提供了一种测定干血片中多种雌激素的方法，用第一萃取剂将雌激素从干血片中萃取，再衍生化，用第二萃取剂将衍生后的雌激素再次萃取，增大了通量，提高了分析效率。