本发明公开了一种大肠杆菌菌株鉴定方法和系统。该鉴定方法是一种用于细菌生物体(具体为大肠杆菌)的检测与识别的方法，基于待测大肠杆菌菌株二代测序获得的核酸序列数据，对核酸序列数据进行数据质控、数据比对和数据组装后，在构建的全基因组多位点序列分型数据库中比对查找到基因序列分型最接近的菌株，得到鉴定结果。本发明基于大肠杆菌全基因组多位点序列基因分型技术，提出了一种全新的大肠杆菌菌株鉴定方法和系统，能满足生物、医药、农业等多个领域生产和科研中更全面、复杂的大肠杆菌菌株鉴定需求。