本发明公开了非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区；所述核酸的3’端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，称为核酸A；使用引物第一寡核苷酸与核酸A的Rc区退火，进行合成步骤；所述核酸A的3’端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。利用本发明的核酸合成方法，目标片段可仅为40bp左右，且不需要引入外源基因序列。