本发明提供了一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂交叉污染带来的实验错误，样品前处理过程引入睾酮和雄烯二酮自身稳定同位素内标实时校正，有效消除系统误差，同时配备定标曲线和质控品，只需要简单的将样品加入到试剂条中，将处理好的样品取出上LC‑MS/MS检测，无需常规的液相色谱串联质谱法检测中常用的固相萃取等所需的各种试剂、耗材和仪器设备等，简单高效，易于临床检测和应用。