本发明提供了一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，包括使用试剂盒对血清样品进行游离睾酮和总睾酮的抗体偶联磁微富集，自动化前处理以及LC‑MS/MS检测，试剂盒包括睾酮分离纯化试剂条，睾酮定标曲线与睾酮质控品，睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮稳定同位素内标、淋洗液和洗脱液。本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂较差污染带来的实验错误。将样品加入到试剂条中，前处理自动化完成，操作过程仅需要12min，完成样品中睾酮的提取，将处理好的样品取出检测，无需常规的检测方法中常用的各种试剂、耗材、仪器设备及其安置空间，简单高效，易于临床检测和应用。