本发明公开了一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用，属于细胞领域。所述建立方法包括：步骤1：将胎牛皮肤组织预处理后剪碎，用胰酶消化液消化，经过滤、离心后，收集细胞沉淀，将所述的细胞沉淀用10％FBS的DMEM培养基吹散，培养，待细胞贴壁稳定后，更换新鲜培养基，得到原代牛皮肤成纤维细胞；步骤2：克隆hTERT基因，并构建hTERT基因慢病毒载体，然后将所述hTERT基因慢病毒转导所述原代牛皮肤成纤维细胞，经培养、筛选、鉴定，得到牛皮肤成纤维永生化细胞系。本发明为牛结节性皮肤病病毒等大型反刍动物疫病提供了重要的基础研究和应用研究试验材料，为相关病毒的分离培养和检测提供了重要的技术平台。