本发明涉及一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法及其应用，本发明提供的检测方法包括以下步骤：S1：提供所述人源环状RNA的有效序列；S2：获得与所述有效序列的小鼠同源序列的目标小鼠基因；S3：获得所述有效序列在步骤S2获得的所述目标小鼠基因的全序列中的位置；S4：根据S3得到的所述位置设计针对所述有效序列的引物；S5：采用S4得到的所述引物检测所述目标小鼠基因是否表达。采用本发明提供的检测方法能够简便、快捷、准确地找到现有circRNA数据库中未有的鼠源circRNA序列，并验证此段序列是否可以被转录出来，为进一步在动物水平上验证circRNA的生物学功能提供了研究基础。