本发明公开了一种用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物及其筛选方法和应用，属于抗青枯病烟草的筛选技术领域。本发明针对烟草抗青枯病提供了两种的相斥相分子标记，分别为烟草基因4370和烟草基因37372的相斥相分子标记；并针对这两个分子标记提供了相应的UTR引物对和SSR引物对。本发明还提供了检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法，利用上述引物对待测烟草品种的基因进行PCR扩增，利用电泳分离技术检测标记，根据是否显示条带，判断待测烟草育种材料或品种是否抗青枯病。上述方法显著提高了抗青枯病烟草品种育种的准确性和鉴别效率，克服了性状表型鉴定困难和常规分子标记对数量性状选择时的低效问题。