本发明公开了一种鞋用生物基高结晶性水性聚氨酯胶粘剂及制备工艺，属于水性聚氨酯技术领域。本发明的胶粘剂包括原料：生物基聚酯多元醇、端羟基聚醚磺酸盐、脂肪族二异氰酸酯、小分子端羟基扩链剂、小分子端氨基扩链剂、催化剂、消泡剂、抗菌剂、流平剂和增粘树脂。本发明采用特殊的工艺顺序控制：①聚酯多元醇大分子、端羟基聚醚磺酸盐与异氰酸酯的聚合；②扩链；③催化剂的逐步添加；④加入丙酮稀释、采用去离子水分散；⑤在上述溶液中加入高活性扩链剂进行二次扩链，通过该工艺进一步提高了胶粘剂的分子量。伴随着聚氨酯分子链软段的结晶，提高了胶粘剂的初粘强度，长链二元酸的引入提高了聚氨酯大分子的耐热性/耐水解性。