本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法。该检测试纸的胶体金结合垫上附着有至少两种农药的金纳米颗粒标记抗体；层析膜上设置有质控线和至少两条检测线，每条检测线采用一种农药的抗原包被而成；所述农药选自毒死蜱、甲拌磷、乐果、啶虫脒、多菌灵、腐霉利、甲氰菊酯、克百威、异丙威、百菌清、氟虫氰、对硫磷、涕灭威、三唑酮、水胺硫磷或对硫磷。通过优选农药种类及其抗原和抗体的制备方法，本发明克服了对多种农药进行同时检测时检测目标相互干扰的问题，具有特异性好、灵敏度高、能够准确定量、能够同时检测多种组分和前处理简单等优点，因而具有很好的应用前景。