本发明属于废水处理领域，涉及一种发酵生产自养型脱氮菌剂的生产工艺，包括：将含有脱氮自养菌的污泥接种至上升式厌氧反应器，使用青石、菱铁矿和单质硫作为反应器的填料，填装过程中分批次依次装入填料和污泥，使泥水混合均匀；所述上升式厌氧反应器填装完毕后，进行挂膜驯化，得到自养反硝化的菌体；将所述自养反硝化的菌体使用发酵法规模化生产，即得。本发明构建了一种以硫铁单质及其化合物为电子供体进行自养反硝化的菌体；使用发酵法规模化生产自养型脱氮菌剂。该菌剂脱氮能力更强，更适合工业污水和市政污水脱氮处理。