本发明公开了一种本发明提供的同时检测黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A的方法。该方法包括下述步骤：1)制备待测黄芩样品溶液和对照品溶液；2)采用高效液相色谱法进行检测；所述高效液相色谱法采用的色谱条件为：流动相：甲醇与质量分数0.1％‑0.4％的磷酸水溶液的混合溶液，其中，甲醇的体积百分含量为65‑70％；洗脱方式：等度洗脱。采用本发明的检测方法可使所述黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和千层纸素A的色谱峰均达到基线分离且分离度大于1.5。本发明以有机溶剂‑磷酸水溶液为流动相，固定洗脱比例，色谱峰峰形好，分离度高，准确度高，成本低，检测时间缩短，提高了分析效率，减少了流动相的消耗。