本发明提供一种基于碳量子点微球的荧光免疫层析试剂卡及其制备方法与应用。该荧光免疫层析试剂卡包括试纸条，试纸条包括样品垫、结合垫和层析膜，层析膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有抗D‑二聚体第一单克隆抗体，质控线上包被有阴性对照抗体；结合垫上包被有碳量子点微球‑抗D‑二聚体第二单克隆抗体、碳量子点微球‑阴性对照抗原。该荧光免疫层析试剂卡以碳量子点微球作为荧光标记物，具有光致发光效率高、发光稳定、抗漂白性强、无闪烁现象、生物相容性好等优点，能够提高检测灵敏度和检测稳定性，并且由于该碳量子点微球是一种环境友好型材料，不含重金属，在试剂卡检测完成后对生物样本灭活即可直接当生活来垃圾处理。