本发明提供了一种抑菌喷雾剂及其制备方法和应用，涉及抑菌喷雾技术领域。具体而言，包括按质量份数计的如下组分：山蜡梅叶挥发油2～5份、表面活性剂1～36份、助溶剂1～9份和水若干。所述抑菌喷雾剂以山蜡梅叶挥发油为有效成分，以纳米微乳液为载体并构建得到一种澄清透明、稳定性好的抑菌喷雾剂；所述抑菌喷雾剂具有良好的抗抑菌效果，无明显的皮肤过敏反应或刺激性，以喷雾剂形式给药，方便使用，给药均匀，起效迅速。同时，本发明还给出了所述抑菌喷雾剂的制备方法和其在抑制大肠杆菌、黄金色葡萄球菌和白色念珠菌中的应用；所述制备方法简单易行，绿色安全，适合批量化生产，具有良好的商业前景。