本发明提供了一种藤黄健骨丸指纹图谱及其构建方法和应用，属于医药技术领域。本发明中藤黄健骨丸指纹图谱的构建方法包括以下步骤：采用甲醇对藤黄健骨丸进行提取，将所得藤黄健骨丸提取液作为供试品溶液；以松果菊苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷的甲醇溶液作为对照品溶液；将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，以对照品溶液的色谱峰为基准，得到藤黄健骨丸指纹图谱。本发明采用高效液相色谱法建立藤黄健骨丸的指纹图谱，能够全面反映藤黄健骨丸的质量，便于更有效地指导投料、严格规范生产操作，同时有利于确保藤黄健骨丸临床用药的安全性和有效性。