本发明公开了一种动物神经系统周细胞单细胞悬液的制备方法，属于生物技术领域。该方法包括：将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入总细胞培养液，过滤后得到细胞混合物A；将所述细胞混合物A首先与内皮细胞梯度分离液混合，纯化分离得到含有周细胞的内皮细胞层。随后利用碘克沙醇溶液进一步分离得到纯的周细胞，该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经周细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经周细胞的特性。