本发明公开了一种从发酵液中分离提取L‑苹果酸钙的方法及应用，步骤如下：（1）酸化；（2）絮凝；（3）板框过滤；（4）超滤；（5）脱色；（6）脱色液碱沉；（7）采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L‑苹果酸钙悬浊液脱水，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2‑4倍，即得L‑苹果酸钙。本提取方法不仅分离提纯效果好，便于操作，所得L‑苹果酸钙的收率和纯度较高，本方法中采用盐酸酸化发酵液，较之常用的硫酸酸化效果更好，酸化过滤后，通过氢氧化钠碱沉L‑苹果酸钙的回收率更高，同时也可避免使用硫酸可能造成的碳化现象，避免生成硫酸钙沉淀，减少环境污染。