本发明涉及药物前处理技术领域，具体涉及一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法。本发明提供的前处理方法，包括：将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液；所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷。本发明采用正庚烷或正己烷作为溶散溶剂，采用乙腈水溶液一步提取，操作简便，提取效率高。他克莫司在正庚烷或正己烷中几乎不溶，在乙腈水溶液中溶解性较好，而他克莫司软膏中的凡士林等油性基质在正庚烷或正己烷中溶解性较好，在乙腈水溶液中溶解性较差，本发明采用正庚烷溶散，乙腈水溶液提取，可有效避免基质对有关物质测定的影响，保证了他克莫司有关物质的有效提取。