本发明涉及PCR扩增操作柜及其使用方法。本发明包括标本制备模块和PCR扩增模块，所述标本制备模块包括标本制备间、底部风腔、侧部风腔和第一顶部风腔，所述标本制备间设置有标本制备操作窗口，所述标本制备间设置有第一进风口和标本制备区，所述第一顶部风腔在内部设置有第一抽风装置和第一消毒过滤装置，所述第一顶部风腔在上面设置有与所述操作柜外部连通的上风道出风口，所述第一顶部风腔在下面设置有与所述标本制备间内部连通的下风道出风口。相对于现有技术，本发明使洁净气体充满整个标本制备间的内部，从而使样品和试剂不被污染，进而防止标本制备间内的样品间出现交叉污染。