本发明涉及一种活体单核细胞增生李斯特氏菌RT－PCR快速检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明以单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因hlyA的mRNA为靶标，通过提取样品RNA，经RT－PCR扩增反应及电泳检测，结果如出现858bp扩增条带，证明该样品存在活体单核细胞增生李斯特氏菌。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可产业化生产，具有检测灵敏度高、周期短、速度快、可操作性强的特点。整个检测过程最长可在23h内完成，其最低检测限可达5cfu/g(ml)样品，对食源性和临床出现的活体单核细胞增生李斯特氏菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定，并可推广应用到环境检测、食品卫生领域、商品检验检疫等领域。