本发明属于生物催化领域，具体涉及一种固定化大肠杆菌制备胸苷的方法。本发明以PVA和卡拉胶为包埋基材，活性碳为添加剂，固定产磷酸化酶的大肠杆菌，得到固定化大肠杆菌；在制备胸苷的反应中，以固定化大肠杆菌为催化剂，以磷酸盐缓冲液为溶剂，2‑脱氧‑α‑D‑核糖‑1‑磷酸二环己基胺盐和胸腺嘧啶为反应底物，生产胸苷。本发明采用固定化大肠杆菌制备胸苷，较好的提高了菌体对底物的耐受性，其稳定性得到提高，使得制备胸苷的收率提高；结果表明，经提纯后，胸苷纯度可达97％以上，收率达90％以上；经过6批次反应后，固定化大肠杆菌无明显活力损失。