本发明公开了一种大粒径琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：提供质量浓度为2％～12％的琼脂糖水溶液作为水相；提供溶有乳化剂的有机试剂作为油相；将所述水相滴加到油相中，搅拌以进行乳化；对乳化后的混合液进行降温固化，得到所述大粒径琼脂糖微球；其中，配置琼脂糖水溶液时，溶解温度为100℃～150℃，溶解时间为20min～250min；乳化剂为司班40、司班60、司班80、司班85、吐温20、吐温60与吐温80中的一种或两种以上的混合物；水相与油相体积比为1:2～1:10，搅拌的转速为50rpm～1000rpm，乳化温度为50℃～100℃。本发明还提供了由所述方法制备得到的大粒径琼脂糖微球。本发明的大粒径琼脂糖微球，其粒径范围为400μm～1000μm，具有很好的耐压、耐高温、耐高流速的性能。