本申请实施例公开了一种显微镜对焦方法、显微镜及相关设备，方法包括：获取镜头获取的初始图像；对初始图像进行边缘检测，得到第一目标物体的第一感兴趣区域和第一背景；利用清晰度评价函数对第一感兴趣区域中的图像进行清晰度评价；根据清晰度评价调整显微镜的焦距，获取对焦完成的第一感兴趣区域的第一清晰图像；将第一清晰图像与第一背景进行拼接。上述方法通过划分目标物体的区域，然后单独对区域中的物体通过清晰度评价进行对焦，其中的目标物体是装置中的小零件，获得目标物体的清晰图像，然后再将清晰的图像和背景拼接，解决自动对焦图像中的由于装置主体和零件不在同一平面导致零件模糊的问题，以便于能够对零件的缺陷进行准确的判断。