本发明属于生物技术领域，具体涉及犬伪中间葡萄球菌性角膜溃疡模型的建立方法；实验犬麻醉后，使用聚维酮碘溶液冲洗角膜和结膜囊，使用乳酸钠林格溶液将残留的聚维酮碘溶液冲洗干净，开睑器开睑，实验犬右侧卧保定，调整显微镜焦距以及犬头部位置，确保眼球完全暴露在视野内；吸取伪中间葡萄球菌菌液，在显微镜观察下注射器针头从瞳孔正中央水平线右侧0.3mm处进针，穿过角膜上皮层，于正中角膜基质层注入菌液，按住进针点拔出注射器，按压片刻；取下开睑器，闭合上下眼睑。该方法实验设备简单，操作方法简便，可成功构建犬伪中间葡萄球菌性角膜溃疡模型，重复性好，不会导致实验犬并发感染和死亡等不理想情况的发生，适用范围广。