本发明公开了一种基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置，同一光源产生的激光被电光调制器周期地调制线偏方向，得到两种光束，其中一束光经空间光调制器调制后在样品上聚焦形成Y方向一维暗斑，另一束光被空间光调制器调制为X方向一维暗斑。两种光斑分别被两台放置在光路上的电光偏转器偏转，进行分时照明，从而得到荧光分子被不同方向一维暗斑的不同位置激发出的光子数，再基于极大似然概率估计的数学模型，对荧光分子进行二维空间定位和取向求解。本发明创新性的采用两个正交方向的一维暗斑通过偏振调制进行分时照明，较之传统方法，在获取分子位置信息的同时可以获取其偶极子取向信息。