本发明公开一种透明质酸/ε‑聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括先用三羟甲基氨基甲烷修饰透明质酸后，引入甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰三羟甲基氨基甲烷改性过的透明质酸并与光引发剂溶液混合，经紫外光照射后浸泡在没食子酸修饰ε‑聚赖氨酸/Fe³⁺的溶液中，即得。本发明首先利用甲基丙烯酸缩水甘油酯的碳碳双键通过紫外光照射产生自由基，发生聚合；其次利用聚赖氨酸与透明质酸产生静电吸引，附着在光交联水凝胶表面；最后利用Fe³⁺的螯合作用，增加交联密度，形成抗菌水凝胶，并具有性能可控、韧性优异、生物相容性好、可生物降解、光照成型等优点，制备条件温和可控，可应用于软骨组织工程材料等生物医用材料领域。