本发明涉及植物蛋白深加工技术领域，具体公开了一种火麻活性肽及其制备方法和应用。本发明制备方法先将预冷的脱脂火麻仁粕和干冰混合粉碎，获得火麻仁粕粉，然后加水和碳酸钙配制成碱性悬浊液，磨浆过筛，接着先后采用混合蛋白酶和中性蛋白酶进行两步酶解，最后灭酶、过滤、离心、脱色和除菌，获得所述火麻活性肽。本发明制备方法以脱脂的高蛋白火麻仁粕为原料，通过高溶出率超微细粉碎协同酶解的方法，提高火麻蛋白的溶解度和酶解效率，所得酶解液中多肽段分子量大部分保持2000Da以下，具有更好的溶解性、完全吸收性和生物活性，而且制备的火麻活性肽纯度高，口感饱满，抗氧化活性高，具有抗氧化、降血压、抗疲劳和提高运动耐受力的功效。