本发明涉及一种病原检测背景微生物判断方法及应用，属于生物信息学分析技术领域。该判断方法包括以下步骤：确定核心背景微生物列表：取若干生物样本，将其中各微生物基因序列数据比对至相应微生物的特征序列区域，与核酸提取浓度或文库浓度进行相关性检验，得到相关性呈负相关的微生物列表，得核心背景微生物列表；确定核心背景微生物校正指数CBI：以上述核心背景微生物列表中所有微生物的特异性比对序列数之和为CBI；背景序列判断：将待测样本中微生物的特异性比对序列数与所述CBI相除得判断值。采用该方法可以背景微生物指数的大小来校正背景相关微生物，根据校正后的量来判断样本中该病原微生物是否存在，能够更为准确的判断结果。