本发明涉及一种判断背景引入微生物序列的方法及其应用，属于生物信息分析技术领域。该方法包括以下步骤：确定背景微生物列表：取若干病原微生物阴性样本，将各微生物丰度的定量值A与核酸总量D进行相关性检验，呈负相关则判定为背景病原微生物；判断模型建立：分别取背景病原微生物的阴性对照样本集和阳性样本集，将背景病原微生物基因序列数据比对至该微生物的特征序列区域，计算丰度，建立判断模型；微生物特异性区域定量分析：获取待测样本中背景病原微生物基因序列数据，采用上述判断模型进行判断。该方法能够准确判断测序所得微生物序列是否为背景引入，且可降低批次假阳或者假阴问题，可广泛应用于病原微生物检测的数据分析中。