本发明公开了一种蛋白合成筛选方法。本发明还公开了一种蛋白筛选芯片，其包括液流层、气动控制层以及弹性膜，所述弹性膜设置于液流层和气动控制层之间。所述筛选方法包括：使待筛选的N端序列片段、目的基因片段和连接混合液在循环液流管路内进行连接反应；将扩增混合液输入循环液流管路，并进行扩增反应；将无细胞蛋白表达混合液输入循环液流管路，并进行无细胞蛋白表达反应，之后进行富集、纯化处理，获得目的蛋白。本发明的快速便捷的蛋白翻译起始区筛选方法集目的基因模板优化、扩增、蛋白表达、纯化和检测一体化，操作简单便捷，可在一天时间内完成对目的蛋白最适载体的筛选，以提高目的蛋白产量。