本发明提供一种免疫磁微粒的偶联方法、稀释液和应用。本发明的抗体‑磁珠偶联工艺采用先在酸性pH条件下对羧基磁珠进行活化，然后在接近中性条件下使活化后的羧基磁珠与抗体进行偶联，温和的反应条件保持了抗体的生物活性，也减少羧基磁珠活化后的聚集，提高了羧基磁珠偶联抗体的效率。本发明提供的封闭液使磁珠上未偶联上抗体的羧基位点被BSA、氨基酸或/和小分子肽和PEG以离子键或共价键结合，同时使偶联在羧基磁珠上的抗体保持正确和稳定的形态，提高检测性能，增强灵敏度。本发明提供的免疫磁微粒稀释液，可使制备的免疫磁微粒，如CA125抗体‑羧基磁珠，经该稀释液稀释后在4℃放置12个月或在37℃放置7天后仍能保持良好的分散性和稳定性。