本发明提供了一种凝血酶响应的DNA纳米机器制备方法及应用，所述纳米机器包括DNA纳米结构、溶栓药物(tPA)复合物和凝血酶适配体链结构；通过排布好的DNA捕获链精确装载tPA分子药物，利用可控的DNA分子“锁扣”链，加入第三条凝血酶适配体链可使DNA纳米结构“上锁”，使得tPA药物包载在DNA纳米结构中。本发明公开的DNA纳米机器可以作为一种纳米尺度的分子机器用于tPA溶栓药物的装载，具有高凝血酶响应性，可有效响应血栓部位凝血酶环境，精准释放凝血酶，从而实现溶栓治疗有效运输到血栓部位，是一种精确载药、可控释放、具有较高溶栓效果的新型溶栓机器。