本发明公开了一种带电粒子束扫描成像设备实际像素尺寸的获取方法，包括:规划晶圆上实际像素尺寸测量的工作区域；将全部待测像素对应的放大倍率区分为第一放大倍率和更高的第二放大倍率；当获取第一放大倍率的实际像素尺寸时，提取满足预设条件的模板，模板包括一或多个子模板，子模板包括子图像和/或独立特征点；当获取第二放大倍率的实际像素尺寸时，提取基于曲线的图像类模板或曲线类模板；依次获得各放大倍率对应的实际像素尺寸，其步骤均包括：移动晶圆采集目标图像，用模板在目标图像中进行匹配，获取模板的位置和匹配位置之间的目标位移，根据晶圆实际位移和目标位移获得实际像素尺寸。本发明可改进成功率、测量精度及时间成本。