本发明公开了一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用，包括以下操作步骤：S1：细胞培养：将细胞和细胞培养液放入到细胞培养槽内，加入完全培养基，于细胞培养箱中培养，同时向培养基中充入过量氧气，对培养基保温在30摄氏度，且培养过程中，持续向培养基中充入氧气；S2：提取上清：将步骤S1中培养基上层及培养后的小粒状的干细胞组织稀释，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液，提取后的培养基添加稀释液稀释，将稀释液置于离心机中8次离心，且每次离心获取上清液。本发明所述的一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用，制成冻干粉后保存时间长，便于携带，使用方便。