本发明提供了一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用，所述重组流感病毒株为携带狂犬病毒基因的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的携带狂犬病毒基因的重组流感病毒；所述狂犬病毒基因位于甲型流感病毒NA片段的开放阅读框内：所述狂犬病毒基因片段的5’端通过自剪接多肽与甲型流感病毒NA片段3端’连接；所述狂犬病毒基因片段的3’端连接包装信号，所述包装信号的序列为NA开放阅读框3’端157bp的同义序列；所述自剪接多肽为T2A或P2A。该重组流感病毒可在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可用于狂犬病毒疫苗的开发、药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产狂犬病毒蛋白。