本发明公开了一种AAV8中和抗体检测方法，使用合适的血清稀释液作为样品稀释液，用含有自主表达萤火虫素酶的基因元件AAV8载体和待测样品共孵育，使AAV8样品混合液感染293T细胞，并通过检测化学发光信号来表征中和活性。本发明所提的一种AAV8中和抗体检测方法，灵敏度高和来源可控，适用于人血液基质中AAV8中和抗体检测试剂盒，该方法以能够自主表达萤火虫素酶的AAV8和人血清样品进行孵育，然后感染293T细胞，孵育一段时间后通过检测293T细胞的萤火虫素酶表达来检测人血清样品中的中和抗体的活性强弱，该方法的方法具有灵敏度高，价格成本较低，生理相关性好，容易进行高通量，标准化操作和验证的特征。