本发明公开了一种基于三维荧光测定果汁中多菌灵含量的方法。通过简单的液液萃取步骤对样品进行前处理，然后在优化的扫描波长和扫描间隔等参数下扫描并收集标准品与样品的三维荧光数据，采用平行因子分析法对所得的数据进行数学分离处理，利用已知浓度的标准品建立校正模型，在含有未知、未校正背景干扰和光谱严重重叠的情况下，实现多菌灵的测定。本发明具不需要复杂的分离操作过程，具有简单、快速、灵敏度高、定量效果好等优点，可实现利用荧光光谱，在复杂背景干扰下果汁中多菌灵含量的准确、快速测定。