本发明涉及一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，包括将抗原稀释至预设浓度后分组静置，洗涤后备用；将HRP标记蛋白分组并分别稀释至不同浓度；将HRP标记蛋白滴入至抗原内，孵育后加入底物夜，依次检测各组标定混合物的亮度，根据HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线以确定HRP抗体的工作浓度。本发明通过实时监测各组HRP标记蛋白与抗原之间的反应情况从而精准确定各组标定混合物在反应过程中释放的实际亮度值并得到精准的浓度‑亮度对应关系，在绘制亮度‑浓度曲线时，能够使曲线更加符合HRP标记蛋白的实际浓度‑亮度对应关系，从而有效提高了本发明所述方法针对HRP标记蛋白的工作浓度的检测精度。