本发明公开了一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用所述方法包括：将细胞外囊泡(EVs)与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由EVs普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将EVs和抗体偶联核酸复合物的混合物与引物、探针一起配制成反应体系，经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，将所述液滴用PCR仪进行热循环扩增反应，随后通过液滴生成仪识别读取液滴，从而对EVs亚群进行分离分析。本发明能实现EVs数字化绝对定量，只需更换抗体就可实现多种EV亚群的精准检测分析；技术简单、稳定、成熟，利用普通PCR仪就可实现临床疾病诊断，利于临床推广转化。