本申请公开了一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用。本申请方法包括，用第一引物对模板核酸进行一次延伸；第一引物包括平台上游引物结合区、UMI和靶标上游引物序列，且平台上游引物结合区和靶标上游引物序列的T替换为dU；然后，向反应体系加入第二引物进行一次延伸；第二引物包括平台下游引物结合区和靶标下游引物序列；然后，向反应体系加入UDG/UNG酶消化dU；消化后，向反应体系加入第三引物进行PCR；第三引物为第一引物平台上游引物结合区序列。本申请方法，通过对引物进行特殊设计，依序向反应体系中加入三种引物，实现使每个原始模板核酸只对应一个UMI，校正每个靶点扩增性偏差，实现靶标基因拷贝数定量检测。