本发明提供了一种石棉相关疾病甲基化标记物的引物组合、试剂盒及其扩增子测序文库的建立方法，包括获取恶性间皮瘤病人、石棉暴露人群和健康对照人群样本全基因组DNA甲基化测序数据、筛选差异甲基化片段/位点、设计DNA甲基化扩增子测序文库构建的引物及扩增子文库构建方法。本发明采用全基因组DNA甲基化测序数据筛选恶性间皮瘤和石棉暴露人群的甲基化标记物，利用高通量扩增子测序的方法对234个样品、50个特定甲基化区域进行联合检测，提高了恶性间皮瘤等石棉相关疾病甲基化标记物筛选的可靠性与有效性，筛选方法高效可行，实现了甲基化标记物检测的高通量和高敏感性，适用于大样本多目标区域的验证，可广泛应用于石棉暴露人群的筛查。