本发明公开了一种制备二代测序文库的方法，属于包含酶、核酸或微生物的测定方法领域。本发明所要解决的技术问题是如何提高制备二代测序文库的建库效率。本发明所提供的制备二代测序文库的方法包括将DNA分子进行连接接头的连接反应得到连接产物，获得二代测序文库；所述连接反应在含有小分子PEG的连接缓冲液中进行；所述小分子PEG为PEG200至PEG1000中任一种或几种。本发明的方法使用PEG600对测序文库制备过程中的连接反应效率有超过20%的显著提升，并可缩短测序接头的连接时间，可使连接产物不需要纯化直接进行文库扩增，使包含PCR扩增步骤的整体建库流程时间缩短至60分钟。