本申请提供了一种同时测定干制酵母中五种核酸碱基的方法，所述五种核酸碱基包括胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤，包括步骤：取样；预处理和对预处理后的样品溶液进行测定；其中，预处理步骤包括：提取：将样品与纯高氯酸混合，并在第一指定温度下水浴加热第一指定时间；净化：加入第二指定量的磷酸二氢铵溶液，加水至第三指定量，过滤，得到预处理后的样品溶液；其中，对预处理后的样品溶液进行测定的步骤包括：检测：使用HPLC‑DAD检测预处理后的样品溶液。本申请可以同时测定干制酵母中胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤，具有优良的重复性和重现性，操作简便快速，能实现高效分离，基线稳定，所用设备易于获得，极具可推广性。