本发明提供了一种测定木质素纤维表面电荷密度的方法，方法包括：在若干份储备溶液中分别添加不同体积的壳聚糖碘化物溶液，进行离子交换反应后，过滤，得到若干份滤液；其中，不同体积的壳聚糖碘化物溶液的浓度均相同，储备溶液为预设浓度的木质素纤维溶液；利用导数光谱法对上述滤液分析，绘制其在选择波长处的吸光度一阶导数值随壳聚糖碘化物添加量的变化的折线图来确定碘离子吸附饱和点；并将碘离子吸附饱和点处的一阶导数值代入至KI标准曲线中，得到吸附饱和时的碘离子浓度；结合储备溶液的体积及其中纤维的绝干质量，得到纤维的表面电荷密度；本发明结合导数光谱法扣除干扰；实现对木质素纤维表面电荷密度的快速测定，测量结果精确度高。