本发明具体提供一种试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法。所述试剂盒用于检测样本中抗结核药物及其代谢物，包括校准品、质控品、仪器质控品以及同位素内标准品；校准品和质控品中均含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉及去乙酰利福平；仪器质控品包括含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉及去乙酰利福平的甲醇溶液；同位素内标准品中包含校准品中所含物质对应的内标物。本发明的试剂盒可检测多种样本类型中抗结核药物及其代谢物的浓度。