本申请提供一种植物根际固氮菌多样性检测引物组、试剂盒及方法。方法包括：对采集的植物样本进行预处理，得到菌悬液；将经过细胞密度计算的菌悬液、乳化剂与融合PCR引物组混合，并在单细胞内将固氮功能基因和标记物种信息的基因连接并扩增，得到融合产物；对融合产物进行萃取，并用琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化融合产物；以纯化融合产物为模板，与巢式PCR引物组混合后，反应得到巢式PCR产物；利用巢式PCR产物制备文库，并进行测序，根据测序结果分析植物根际固氮菌的多样性。能够在单细胞水平上将固氮功能基因与标记物种信息的基因连接起来，根据测序结果分析微生物的功能基因与物种进化间的联系。操作简单且成本低廉。