本发明提供了一种多肽自组装纳米药物，属于多肽纳米材料技术领域，所述纳米药物包括两亲性分子通过自组装形成的球形纳米颗粒，所述两亲性分子包括亲水端和疏水端，所述亲水端通过D型多肽拮抗剂、响应多肽、抗血管新生多肽和连接肽通过共价键依次连接而成，所述疏水端包括直链脂肪酸，所述疏水端通过共价键连接在所述连接肽的N端。该纳米药物能够在肿瘤部位实现高效富集和长效滞留，且该纳米药物在高表达豆荚蛋白酶的肿瘤局部可被响应性切割，释放抗血管多肽和D型多肽拮抗剂，在抑制肿瘤部位血管新生的同时，改善肿瘤免疫抑制的微环境，防止肿瘤术后复发与转移。本发明还提供了一种多肽自组装纳米药物的制备方法和应用。